Иммуноокрашивание нарезанных образцов гидрогелей с добавлением ХС, ГК или ГКХС. Гидрогели без добавок (необработанные) были использованы в качестве контрольных проб. Окрашивание показало, что во всех исследуемых группах наблюдалось накопление белков коллагена типа I и коллагена типа II с течением времени. Все микрофотографии были сделаны при одинаковом увеличении с помощью составного микроскопа Leitz DM-RB (с линзой объектива с десятикратным увеличением), оборудованного камерой Sony DSC-V3. 4. Обсуждение Основной проблемой в инженерии искусственных хрящевых тканевых структур является разработка оптимизированной культурной среды, которая поддерживает выживаемость и количественный рост внедренных клеток хондроцитов, при этом также сохраняет фенотип хондроцитов и поддерживает биосинтез компонентов внеклеточного матрикса, специфичных для хряща. Результаты многих исследований показали, что количественный рост хондроцитов в монослойных культурах на стандартных чашках Петри приводит к их постепенной дедифференциации, что характеризуется переходом от синтеза коллагена II к синтезу коллагену I, снижению секреции аггрекана и появлению фибробластической морфологии [21]. Наоборот, внедрение хондроцитов в 3D гидрогели, состоящие из различных натуральных полимеров или синтетических полимеров, способствует поддержанию нормальных шаблонов экспрессии генов и секреции матрикса хряща [5,6,7,22]. Перка и др. [9] продемонстрировали преимущества скаффолд-системы фибрин-альгинатных гидрогелей, которая обеспечила лучшую среду для длительного выращивания хондроцитов, чем гидрогели, состоящие только из фибрина или альгината. На основании результатом этих более ранних отчетов мы наблюдали, что хондроциты новорожденных свиней, выращиваемые в монослойных культурах, демонстрировали прогрессирующее снижение экспрессии генов коллагена II и аггрекана в период выращивания 6-12 дней и соответствующее увеличение экспрессии коллагена I (дополнительный рисунок S1). Наоборот, хондроциты, выращиваемые в фибрин-альгинатном гидрогеле, демонстрировали значительно более высокое соотношение экспрессии мРНК коллагена II относительно коллагена I по сравнению с хондроцитами, выращенными в монослое (дополнительный рисунок S2). Целью настоящего исследования являлась проверка влияния дополнения фибрин- альгинатного гидрогеля экзогенными ГК и ХС на параметры роста популяции хондроцитов, синтез внеклеточного матрикса и экспрессию генов, специфичных для хряща. Более того, мы хотели определить, будет ли дополнение гидрогеля ГК и ХС в комбинации (ГКХС) иметь совокупное действие на данные показатели хондроцитов. Вы выявили, что добавление либо ХС, либо ГК, либо ГКХС увеличивало уровни синтеза сульфатированного ГАГ в хондроцитовых культурах в фибриновом/альгинатном гидрогеле. Это соответствует более ранним отчетам, в соответствии с которыми экзогенные ГК и ХС могут усилить синтез внеклеточного матрикса в культурах хондроцитов [10,11,13]. Интересно отметить, что стимулирующее действие ХС и ГК на накопление сульфатированного ГАГ, которое мы наблюдали, было заметно только в течение первой недели выращивания. Возможно, действие экзогенных ХС и ГК становится еле заметным через две редели выращивания из-за увеличения отложений недавно синтезированного аггрекана, эндогенного хондроитин сульфат протеогликана, специфичного для хряща, хондроцитами, внедренными в фибрин-альгинатный гидрогель. Предыдущее исследование, проведенное Сузанте и др. [13], показало, что синтез матрикса замедлялся с возрастающим накоплением ГАГ в хондроитин сульфат - коллаген I скаффолд-системе для выращивания хондроцитов. Вопреки имеющимся ожиданиям было выяснено, что стимулирующее действие добавления ХЧ и ГК на синтез сульфатированного ГАГ в фибрин-альгинатном гидрогеле не было совокупным. Возможно, концентрация добавок ХС и ГК равная 1 мг/мл, использованная в проведенных экспериментах, была достаточна сама по себе для максимального стимулирования синтеза ГАГ матрикса. Добавление только ХС или комбинации ХС и ГК также оказывало положительное влияние на рост популяции хондроцитов в фибрин-альгинатных гидрогелях. Через две недели выращивания гидрогели с добавлением ХС и ГКХС демонстрировали значительно более высокий общий уровень аккумуляции ДНК, чем гидрогели без добавок. Добавление только ГК не вызывало статистически значимого увеличения среднего уровня клеточного ДНК. Однако, добавление ГК в комбинации с ХС имело совокупное действие на количественный рост хондроцитов, который был более выраженным, чем при добавлении только ХС. Также следует отметить стимулирующее действие добавления ХС и ГКХС на рост популяции хондроцитов не наблюдалось в течение первой недели выращивания в гидрогеле. Похожие тенденции наблюдались в исследованиях, проведенных ван Сузанте и др. [13] и Акмалом и др. [10], которые отметили временную задержку воздействия добавления ГК и ХС на количественный рост выращиваемых хондроцитов. В рамках проведенного исследования также проводилась проверка того, влияет ли добавление ХС и/или ГК в фибрин-альгинатные гидрогели на уровни экспрессии транскриптов аггрекана, специфического для хряща, и коллагена II или уровень мРНК для коллагена I, маркера для дедифференцированных хондроцитов. Однако, данные количественной ПЦР не показали статистически значимого влияния добавления ХС, ГК или ГКХС на уровни экспрессии любого из этих целевых генов. Из этого можно сделать вывод, что стимулирующее действие добавления ХС и ГК на аккумулирование ГАГ могло быть вызвано каким-либо посттранскрипционным влиянием на эксперссию сульфатированных протеогликанов матрикса, таких как аггрекан. Полученным результатам также соответствуют результаты более ранних исследований Нишимото и др.[23]; в соответствии с ними добавление ХС и ГК с малой молекулярной массой не имеет значительного воздействия на уровни экспрессии транскриптов коллагена II и аггрекана в 3D системах выращивания хондроцитов. В соответствии с экспрессией транскриптов мРНК коллагена II и мРНК коллагена I в использованных культурах гидрогелей иммуноцитохимическое окрашивание подтвердило, что белки коллагенов типа II и типа I были внесены в фибрин-альгинатный гель. Как для коллагена II, так и для коллагена I иммуноокрашивание оказалось преимущественно околоклеточным. Таким образом, присутствие белков как коллагена II, так и коллагена I в фибрин-альгинатных гидрогелях указывает на то, что внесенные клетки могут быть смесью фенотипически различных хондроцитов, а также некоторых хондроцитов, подвергшихся дедифференциации. К сожалению, мы не смогли определить, добавление какого именно компонента (ХС, ГК или ГКХС) вызвало количественные изменения количества белков коллагена II или коллагена I из-за разницы в качестве гистологических срезов, полученных от разных проб гидрогелей, а также различной интенсивности иммуноокрашивания в различных зонах одного и того же образца. Текущее исследование имеет большое количество ограничений, которые должны быть приняты во внимание во время последующих исследований. Мы испытывали только одну концентрацию ХС и ГК (0,1мг/мл), добавляемую в использованные фибрин-альгинатные гидрогели, при этом оптимальное действие на показатели хондроцитов могло быть при более высоких или более низких дозах. Акмал и др. [10] продемонстрировали, что дозировка ГК влияет на аккумуляцию матрикса и количественный рост хондроцитов и, скорее всего, действие ХС и ГК в комбинации также зависит от дозировки. Более того, кроме ХС и ГК есть большое количество других макромолекул (например, коллаген II), которые могли быть проверены отдельно или в комбинации в качестве возможных дополнений для улучшения качества тканеинженерных хрящевых структур, а также стимулирование факторов роста растворимых веществ, например, костные морфогенетические белки (BMP) и трансформирующих ростовых факторов бета 1 (TGF-βs), которые увеличивают транскрипцию специфических хрящевых генов и синтез матрикса. В последующих исследованиях важно будет провести механические испытания [4] гидрогелей после длительного выращивания, чтобы определить влияние добавок на несущую способность структур. Разработка оптимизированных режимов внесения добавок в 3D культуры хондроцитов, которые эффективны для сохранения видоизмененного фенотипа хондроцита и синтеза внеклеточного матрикса со свойствами, похожими на свойства натурального хрящевого матрикса, является важной составляющей в инженерии имплантируемых заменителей хрящевых тканей, способных к функциональной интеграции с окружающими натуральными тканями. Следующим шагом является синтез искусственных хрящевых структур, которые имитируют зонную структуру натурального суставного хряща с неоднородными биологическими и механическими свойствами в зависимости от слоя [22, 24]. 5. Выводы Результаты исследования показали, что добавление ХС и ГК, как отдельно, так и в комбинации, увеличивает аккумуляцию ГАГ матрикса и количественный рост клеток хондроцитов, внесенных в 3D фибрин-альгинатные гидрогели. Стимулирующее действие ХС и ГК на рост количества хондроцитов было совокупным и стало очевидным через две недели выращивания in vitro. Наоборот, стимулирующее действие ХС и ГК на синтез сульфатированного ГАГ было несовокупным и было заметно только в течение первой недели выращивания. Важным фактором, который следует учитывать при разработке усовершенствованных скаффолд-систем для тканевой инженерии хрящевой ткани, является создание искусственной микросреды с оптимизированным макромолекулярным составом, который поддерживает видоизмененный фенотип внесенных хондроцитов и который ускоряет устойчивый биосинтез внеклеточного матрикса, характерного для хряща. Благодарности Авторы выражают признательность за финансовую поддержку Совету по естественнонаучным и инженерным исследованиям Канады (NSERC), выдавшему Уильяму М. Кулику научный грант, а также Фонду исследований в области здравоохранения провинции Саскачеван (SHRF), выдавшему Сюнбяо Чэну грант на проведение группового исследования в области здравоохранения (этап 2). Выражаем благодарность компании «Прери Свайн Сентер» за предоставление поросят.
Дополнительные файлы
Вклад авторов Кристофер Джей Литл, Уильям М. Кулик и Сюнбяо Чэн придумали и разработали экспериментоы; Кристофер Джей Литл провел все эксперименты; Кристофер Джей Литл и Уильям М. Кулик проанализировали данные; Уильям М. Кулик и Сюнбяо Чэн предоставили реактивы и материалы. Данную работу выполнил Кристофер Джей Литл, проверил Уильям М. Кулик. Конфликт интересов Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов. Использованные источники 1. Lawrence R.C., Felson D.T., Helmick C.G., Arnold L.M., Choi H., Deyo R.A., Gabriel S., Hirsch R., Hochberg M.C., Hunder G.G., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States part II. Arthritis Rheum. 2008;58:26–35. [PMC free article] [PubMed] 2. Woodfield T.B.F., van Blitterswijk C.A., de Wijn J., Sims T.J., Hollander A.P., Riesle J. Polymer scaffolds fabricated with pore-size gradients as a model for studying the zonal organization within tissue-engineered cartilage constructs. Tissue Eng. 2005;11:1297–1311. doi: 10.1089/ten.2005.11.1297.[PubMed] [Cross Ref] 3. Obradovic B., Martin I., Padera R.F., Treppo S., Freed L.E., Vunjak-Novakovic G. Integration of engineered cartilage. J. Orthop. Res. 2001;19:1089–1097. doi: 10.1016/S0736- 0266(01)00030-4.[PubMed] [Cross Ref] 4. Little C.J., Bawolin N.K., Chen X.B. Mechanical properties of natural cartilage and tissue engineered constructs. Tissue Eng. B Rev. 2011;17:213–227. doi: 10.1089/ten.teb.2010.0572. [PubMed] [Cross Ref] 5. Gong Y., He L., Li J., Zhou Q., Ma Z., Gao C., Shen J. Hydrogel-filled polylactide porous scaffolds for cartilage tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res. B. 2006;82:192–204. [PubMed] 6. Lee C.R., Grad S., Gorna K., Gogolewski S., Goessl A., Alini M. Fibrin-polyurethane composites for articular cartilage tissue engineering: A preliminary analysis. Tissue Eng. 2005;11:1562–1573. doi: 10.1089/ten.2005.11.1562. [PubMed] [Cross Ref] 7. Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes for tissue engineering in alginate beads enhances chondrocytic phenotype compared to conventional monolayer techniques. Acta Orthop. Scand. 2003;74:6–15. doi: 10.1080/00016470310013581. [PubMed] [Cross Ref] 8. Lindenhayn K., Perka C., Spitzer R., Heilmann H., Pommerening K., Mennicke J., Sittinger M. Retention of hyaluronic acid in alginate beads: Aspects for in vitro cartilage engineering. J. Biomed. Mater. Res. A. 1999;44:149–155. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(199902)44:2<149::AID- JBM4>3.0.CO;2-C.[PubMed] [Cross Ref]
9. Perka C., Spitzer R.S., Lindenhayn K., Sittinger M., Schultz O. Matrix-mixed culture: New methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants. J. Biomed. Mater. Res. A. 2000;49:305–311. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(20000305)49:3<305::AID- JBM2>3.0.CO;2-9. [PubMed] [Cross Ref] 10. Akmal M., Singh A., Anand A., Kesani A., Aslam N., Goodship A., Bentley G. The effects of hyaluronic acid on articular chondrocytes. Bone Joint J. 2005;87:1143–1149. doi: 10.1302/0301- 620X.87B8.15083. [PubMed] [Cross Ref] 11. Kawasaki K., Ochi M., Uchio Y., Adachi N., Matsusaki M. Hyaluronic acid enhances proliferation and chondroitin sulfate synthesis in cultured chondrocytes embedded in collagen gels. J. Cell. Physiol. 1999;179:142–148. doi: 10.1002/(SICI)1097-4652(199905)179:2<142::AID- JCP4>3.0.CO;2-Q. [PubMed][Cross Ref] 12. Bassleer C.T., Combal J.P., Bougaret S., Malaise M. Effects of chondroitin sulfate and interleukin-1 beta on human articular chondrocytes cultivated in clusters. Osteoarthr. Cartil. 1998;6:196–204. doi: 10.1053/joca.1998.0112. [PubMed] [Cross Ref] 13. Van Susante J.L.C., Pieper J., Buma P., van Kuppevelt T.H., van Beuningen H., van der Kraan P.M., Veerkamp J.H., van den Berg W.B., Veth R.P.H. Linkage of chondroitin-sulfate to type I collagen scaffolds stimulates the bioactivity of seeded chondrocytes in vitro. Biomaterials. 2001;22:2359–2369. doi: 10.1016/S0142-9612(00)00423-3. [PubMed] [Cross Ref] 14. Enobakhare B.O., Bader D.L., Lee D.A. Quantification of sulfated glycosaminoglycans in chondrocyte/alginate cultures, by use of 1,9-dimethylmethylene blue. Anal. Biochem. 1996;243:189–191. doi: 10.1006/abio.1996.0502. [PubMed] [Cross Ref] 15. Lee C.S.D., Gleghorn J.P., Won Choi N., Cabodi M., Stroock A.D., Bonassar L.J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 2007;28:2987–2993. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.02.035. [PubMed] [Cross Ref] 16. Williams G.M., Klein T.J., Sah R.L. Cell density alters matrix accumulation in two distinct fractions and the mechanical integrity of alginate-chondrocyte constructs. Acta Biomater. 2005;1:625–633. doi: 10.1016/j.actbio.2005.07.009. [PubMed] [Cross Ref] 17. Labarca C., Paigen K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biochem. 1980;102:344–352. doi: 10.1016/0003-2697(80)90165-7. [PubMed] [Cross Ref] 18. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 2009;55:611–622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.[PubMed] [Cross Ref] 19. R Development Core Team . R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria: 2009. 20. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2002;30 doi: 10.1093/nar/30.9.e36. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
21. Cheng T., Maddox N.C., Wong A.W., Rahnama R., Kuo A.C. Comparison of gene expression patterns in articular cartilage and dedifferentiated articular chondrocytes. J. Orthop. Res. 2012;30:234–245. doi: 10.1002/jor.21503. [PubMed] [Cross Ref] 22. Izadifar Z., Chen X., Kulyk W. Strategic design and fabrication of engineered scaffolds for articular cartilage repair. J. Funct. Biomater. 2012;3:799–838. doi: 10.3390/jfb3040799. [PMC free article][PubMed] [Cross Ref] 23. Nishimoto S., Takagi M., Wakitani S., Nihira T., Yoshida T. Effect of chondroitin sulfate and hyaluronic acid on gene expression in a three-dimensional culture of chondrocytes. J. Biosci. Bioeng. 2005;100:123–126. doi: 10.1263/jbb.100.123. [PubMed] [Cross Ref] 24. Nguyen L.H., Kudva A.K., Saxena N.S., Roy K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 2011;32:6946–6952. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.06.014. [PubMed][Cross Ref]
Статьи из Журнала функциональныз иоматериалов (Journal of Functional Biomaterials) предоставлены Институтом междисциплинарных цифровых публикаций (Multidisciplinary Digital Publishing Institute, MDPI)