Влияние хондроитин сульфата и гиалуроновой кислоты на хондроциты, выращенные в
фибрин-альгинатном гидрогеле
фибрин-альгинатном гидрогеле
Кристофер Джей Литл 1 , Уильям М. Кулик 2* и Сюнбяо Чэн 1,3
Данная статья была процитирована авторами других статей из библиотеки PMC.
Данная статья была процитирована авторами других статей из библиотеки PMC.
Краткое содержание
Остеоартроз яввляется болезненным дегенеративным заболеванием суставов, которое могло бы лучше поддаваться лечению, если технологами тканевой инженерии были бы разработаны методы создания долговечных заменителей тканей суставных хрящей методом тканевой инженерии. Многим существующим в настоящее время тканеинженерным моделям хрящей не достает химических раздражителей и благоприятной для клеток среды, чтобы способствовать накоплению матрикса и количественному росту клеток, что является необходимым при восстановлении суставного хряща. Целью данного исследования являлась проверка эффективности использования фибрин-альгинатного гидрогеля, содержащего гиалуроновую кислоту (ГК) и/или добавки хондроитин сульфата (ХС), для выращивания хондроцитов. Хондроциты новорожденных свиней, выращенные в фибрин-альгинатном гидрогеле, сохраняли свой фенотип лучше, чем хондроциты, выращенные в монослое, что подтверждается результатами анализа уровня их экспрессии при сравнении мРНК копий коллагенов типа II и типа I. Добавление ГК и ХС в гидрогели обеспечило увеличение выработки гликозаминогликана (ГАГ) матрикса в течение первой недели выращивания. Тем не менее, воздействие данных добавок на накопление матрикса не было совокупным и не наблюдалось по истечении двух недель выращивания. Добавление в гидрогели ХС или комбинации ХС и ГК привело к увеличению популяции клеток хондроцитов после двух недель выращивания. Результаты статистического анализа показали, что воздействие ГК и ХС на количество хондроцитов может быть совокупным. В данном исследовании выдвигается предположение, что добавление ХС и/или ГК оказывает положительное влияние на синтез хрящевого матрикса и количественный рост хондроцитов в трехмерных (3D) фибрин-альгинатных гидрогелях. Ключевые слова: остеоартроз, гиалуроновая кислота (ГК), гидрогель, тканевая инженерия
1. Введение Остеоартроз представляет собой термин, описывающий эрозию или разрушение суставного хряща, что, ввиду неспособности хряща к естественной самостоятельной регенерации, вызывает серьезные проблемы со здоровьем у людей во всем мире. Тканевая инженерия хрящевой ткани является дисциплиной, направленной на восстановление поражений хрящевой ткани при помощи искусственных хрящевых структур. Данные структуры состоят из биосовместимой трехмерной (3D) культурной среды, засеянной в суспензии с хондроцитами или мезенхимальными хондропрогениторными клетками. Данная культурная среда обеспечивает первоначальную механическую поддержку клеток, а также наличие микросреды, стимулирующей количественный рост клеток, а также поддержание или приобретение обособленного фенотипа хондроцита. Тем не менее, данная искусственная хрящевая структура зачастую обладает более низким уровнем внеклеточного матрикса по сравнению с натуральным хрящом. Это является серьезной проблемой тканеинженерных хрящей, так как механические свойства нового хряща и его интеграция в собственный хрящ пациента зависят от уровня выделения внеклеточного матрикса.
В настоящее время исследуются несколько различных методов увеличения накопления матрикса. Например, было продемонстрировано, что тип 3D-культурной среды влияет на накопление матрикса: в среде, содержащей гидрогели, выше уровень накопления внеклеточного матрикса и количественного роста клеток по сравнению с твердыми скаффолдами . Было продемонстрировано, что альгинатный гидрогель улучшает удержание фенотипа в хондроцитах по сравнению с традиционной монослойной культурой, а при добавлении фибрина в альгинат улучшается адгезия и количественный рост хондроцитов. Тем не менее, несмотря на то, что смешанный фибрин-альгинатный гидрогель показал лучшие результаты, чем альгинатный, к настоящему времени не проводился непосредственный сравнительный анализ удержания хондрогенного фенотипа в данном смешанном гидрогеле, а также в свежевыделенных хондроцитах или хондроцитах, выращенных в монослое. Другим методом стимулирования синтеза внеклеточного матрикса в тканеинженерных хрящевых структурах является добавление в гидрогель и культурную среду макромолекул, улучшающих показатели удержания их фенотипа. Примером данных молекул является растворенная форма естественных компонентов внеклеточного матрикса, таких как гиалуроновая кислота (ГА) и хондроитин сульфата (ХС). Оба исследования, проведенные Акмалом и др. и Кавасаки и др., продемонстрировали лучшее накопление сульфатированного гликозаминогликана (ГАГ), а также количественный рост хондроцитов в культурах, содержащих гидрогель с добавками ГК, по отношению к контрольным образцам гидрогеля без добавок. Таким же образом, при добавлении ХС также наблюдалось увеличение синтеза ГАГ и количественный рост клеток в 3D-культурах хондроцитов. Целью данного исследования является характеризация воздействия добавления ГК и ХС на синтез внеклеточного матрикса, количественный рост хондроцитов и экспрессию специфических генов хряща в 3D-культурной среде с фибрин-альгинатным гидрогелем, а также определение того, являются ли данные воздействия совокупными.
2. Материалы и методы
2.1. Изоляция хондроцитов
Суставной хрящ был выращен из бедренных и плечевых головок, задних и средних суставных выступов и коленных чашечек новорожденных свиней. Подопытные свиньи были предоставлены компанией «Прери Свайн Сентер» (Саскатун, Саскачеван, Канада); они умерли естественной смертью не более чем за 24 часа до диссекции. Хрящ был измельчен на фрагменты 1-2 мм при помощи сита и подвергнут последующему расщеплению, во время которого ткань выдерживалась 1 час (при температуре 37 °C в среде 5% CO 2 , при ОВ 100 %) с 10 мг/мл проназы («Берингер»/«Роче», Миссиссога, Канада) в среде Игла, модифицированной по методу Дульбекко, (DMEM) («Сигма-Аддрич», Оквилл, Канада) с добавлением 0,292 мг/мл глютамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б, 100 мкг/мл канамицина (GAK), а затем обработан 2 мг/мл коллагеназы (тип IA, «Сигма-Алдрич») в DMEM с добавлением 10 % сыворотки крови эмбрионов коров и GA, выдерживался 4 часа при температуре 37 °C и периодически перемешивался. Полученное в результате расщепленное вещество было пропущено через фильтр Nitex с размером пор 100 мкм, а изолированные хондрокситы были выделены посредством центрифугирования (10 минут, 300 g) и заново смешаны с DMEM/10 % сывороткой крови эмбрионов коров/GAK. Плотность клеток была определена с использованием гемоцитометра и отрегулирована до значения 5 × 10 7 клеток на мл.
2.2. Подготовка гидрогеля и засеивание хондроцитов
Альгинат («Сигма-Алдрич») и фибриноген («Сигма-Алдрич») были растворены в 150 мМ NaCl и 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) до базовой концентрации 30 мг/мл альгината и 62,5 мг/мл фибриногена, а затем стерилизованы посредством фильтрации. Затем базовый раствор альгината в количестве 30 мг/мл смешивался либо с 0,25 мг/мл ГК (из петушиного гребня; «Сигма-Алдрич»), либо с 0,25 мг/мл ХС (ХС-A коровьей трахеи; «Сигма-Алдрич»), либо с 0,25 мг/мл ГК + 0,25 мг/мл ХС, либо ни с одной из добавок. Одинаковые аликвоты фибриногена и базового раствора альгината с добавками были объединены и распределены на 157 мкл аликвоты в стерильные микротрубки объемом 1,5 мл. Затем 19,6 мкл суспензии клеток хондроцитов (5 × 10 7 клеток на мл) были повторно суспендированы в фибриногенную/альгинатную смесь в каждой трубке. Затем в каждую трубку было добавлено по 19 6 мкл раствора тромбина 100 ед/мл («Сигма-Алдрич»), после чего трубки выдерживались в течение 15 минут при температуре 37 °C для ускорения расщепления молекул фибриногена и образования фибринового геля. Получившийся в результате гель был покрыт 588 мкл 102 мМ CaCl2 и выдерживался 20 минут при температуре 37 °C для сшивания альгината. В результате этого было получено 194 мкл гидрогеля, окончательная концентрация компонентов в котором составила 25 мг/мл фибриногена, 12 мг/мл альгината, 5 × 10 6 клеток/мл, 10 ед/мл тромбина, а окончательная концентрация добавок составила 0,1 мг/мл ГК и/или 0,1 мг/или 0,1 мг/мл ХС. Полимеризованные пробки из гидрогеля были помещены в отдельные лунки 12-луночных планшетов для тканевых культур NUNC® (диаметр лунки - 2,1 см, «Термо Фишер Сайентифик», Оттава, Канада) и погружены в 2 мл среды DMEM/10 % сыворотки крови эмбрионов коров/GAK с добавлением либо 0,1 мг/мл ГК, либо 0,1 мг/мл ХС, либо 0,1 мг/мл ГК +0,1 мг/мл ХС (ГКХС), либо без добавок. Концентрация 0,1 мг/мл ГК, использованная в проведенных экспериментах, способствовала синтезу матрикса и количественному росту клеток в 3D хондроцитовых культурах [10,11], при этом добавление 0,1 мг/мл ХС обеспечивало увеличение роста матрикса [12].
2.3. Забор гидрогелей
Был проведен факторный эксперимент с участием группы проб гидрогелей (n = 8 для каждой группы дополнений), отобранной по истечении одной недели нахождения в культуре, другой группы, отобранной спустя две недели (n = 6 для каждой обработки), а также пяти гидрогелей без добавок, отобранных непосредственно в начале эксперимента (0 дней). Средний сырой вес гидрогелей через неделю нахождения в культуре составил 123 мг (± стандартное отклонение 15,6) и значительно не отличался для различных экспериментальных групп. Отобранные гидрогели были промыты в солевом растворе Хенкса в течение 10 минут, после чего они выдерживались при температуре 37 °C с 471 мкл раствора для растворения гидрогеля (90 мМ NaCl, 55 мМ цитрата натрия, 30мМ ЭДТА, 0.1 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0.2 мМ CaCl 2 , 0,2 мг/мл протеиназы K («Инвитроджен Лайф Текнолоджиз», Берлингтон, Канада) до полного растворения гелей. Была взята аликвота получившейся пробы 30,4 мкл, впоследствии смешанная с 70,6 мкл воды тройной дистилляции и удерживаемая при температуре 4 °C в целях последующего использования для количественной оценки сульфатированного ГАГ согласно описанию ниже. Оставшаяся проба гидрогеля была центрифугирована (5 мин, 4 °C, 300 g), надосадочная жидкость была удалена, а гранулированные клетки были вновь смешаны со 100 мкл солевого раствора Хенкса. Аликвота данной суспензии клеток в количестве 10 мкл была смешана со 160 мл солевого раствора Хенкса и заморожена для количественного определения ДНК при помощи красителей Хехст (n = 5, базовые гидрогели без добавок; n = 7, для недели 1; и n = 5, для недели 2 для каждой из четырех исследуемых групп). В пробах для недели 1 оставшиеся 100 мкл суспензии клеток были смешаны с 300 мл реактива TRIzol® LS («Инвитроджен Лайф Текнолоджиз»). Клетки были лизированы путем многократной аспирации через иглу для шприца 27 калибра, а затем заморожены при -80 °C для последующего анализа РНК. По одной пробе гидрогеля из каждой исследуемой группы для периодов времени 1 и 2 недели были использованы для гистологического разделения и окрашивания. Гидрогели были промыты в солевом растворе Хенкса, а затем помещены в раствор формальдегида (3,7 % формальдегида в фосфатно-буферном солевом растворе с добавлением Mg2+и Ca2+) на 30 минут для фиксирования клеток. Фиксированные пробы гидрогеля в течение ночи вымачивались в растворе сахарозы для криоконсервирования (30 % сахарозы в фосфатно- буферном солевом растворе с добавлением Mg2+и Ca2+), после чего были внедрены в смесь для заливки и замораживания срезов (Tissue-Tek) и заморожены при -80 °C до криостатитеского разделения и иммуноцитохимического окрашивания (см. раздел 2.7).
2.4. Анализ сульфатированного ГАГ
Некоторые пробы гидрогеля (n = 7 для однонедельных культур; n = 5 для двухнедельных культур каждой исследуемой группы) были использованы для проведения биохимического анализа общего содержания сульфатированного ГАГ. Результаты количественного определения при помощи 1,9-диметил-метиленового синего, использованные для при выполнении анализа сульфатированного ГАГ, были заимствованы из различных протоколов, найденных в литературных источниках [10,14,15,16], и модифицированы для применения с альгинатом посредством регулирования уровня pH красителя до 1.5. Другими словами, 21 мг диметил-метиленового синего («Сигма-Алдрич») были растворены в 5 мл абсолютного этанола. Затем было добавлено 2 г формиата натрия, и полученный раствор был смешан с 800 мл воды тройной дистилляции. В раствор была добавлена муравьиная кислота (95 %, «Сигма-Алдрич») до достижения уровня pH раствора 1,5, а также была добавлена дистиллированная вода до окончательного объема 1 л. Был создан набор стандартных образцов ГАГ постредством смешивания засеянных фибрин-альгинатных гидрогелей (согласно разделу 2.2), в которые были добавлены известные количества ХС (с окончательной концентрацией 0–100 мкг/мл). Аликвота разбавленной пробы гидрогеля 48 мкл (см. раздел 2.3) была добавлена к 300 мкл красителя диметил-метиленового синего и выдерживалась при комнатной температуре в течение одного часа. После этого пробы и стандарты были центрифугированы (15 мин, 16 °C, 11 500 g), и по 280 мкл каждой надосадочной жидкости были помещены при помощи пипетки в планшеты на 96 лунок. Данные о поглощении считывались при 600 нм с использованием спектрофотометрического планшет-ридера (SLT Spectra; «Текан», Моррисвилл, Северная Дакота, США). Был проведен контрольный эксперимент для подтверждения того, что экзогенный ХС, внесенный в гидрогели с добавлением ХС, не создавал фонового сигнала помехи при количественном определении с помощью диметил-метиленового синего при накоплении сульфатированного ГАГ. Значительных различий в первоначальных данных поглощения диметил-метиленового синего, полученных с использованием гидрогелей с добавками ХС, относительно гидрогелей без добавок (данные не показаны) обнаружено не было. Таким образом, было подверждено, что количество растворенных экзогенных ХС, оставшихся в гидрогелях после промывания в солевом растворе Хенкса в течение 10 минут (см. раздел 2.3) было недостаточным для того, чтобы создать помехи при количественном определении с использованием диметил-метиленового синего при накоплении сульфатированного ГАГ.
2.5. Количественное определение ДНК
Некоторые пробы были подвержены количественному флуориметрическому определению ДНК с помощью модифицированного метода Лабарка и др. [17]. Клетки были высвобождены из растворенных гидрогелей (см. раздел 2.3) и разрушены ультразвуком. 70 мкл аликвота клеток, разрушенных ультразвуком, была смешана с 30 мкл 4 мкг/мл красителя Хехст 33258 («Сигма-Алдрич») и 100 мкл 2х буфера (0,1 M NaH 2 PO 4 , 4 M NaCl, pH 7,4). Затем пробы были загружены в черный микротитрационный планшет на 96 лунок и было определено свечение с помощью планшет-ридера Fluorolite 1000 («Дайнекс Текнолоджиз», Уэртинг, Великобритания) при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны излучения 458 нм. Были проверены пробы набора ДНК стандартов (0–4 мкг/100 мкл, ДНК курицы) на абсолютное количественное определение содержания ДНК.
2.6. Анализ РНК методом количественной ПЦР в реальном времени (qPCR)
Клетки, высвобожденные из растворенных гидрогелей, были лизированы в реактиве TRIzol® LS как описано в разделе 2.3. Лизат был центрифугирован (10 мин, 12 000 g, 4 °C) для осаждения всех нерастворимых посторонних частиц. Надосадочная жидкость была смешана с 80 мкл хлороформа, выдерживалась при комнатной температуре в течение 5 минут, затем была центрифугирована (15 мин, 12 000 g, 4 °C) для отделения водных и органических фаз. Верхняя водная фаза была снята и смешана с 70 % этанолом в равном объеме. Этот раствор был затем добавлен в РНК колонну HiBind из набора E.Z.N.A™ Total RNA («Омега», «БиоТек», Норкросс, Джорджия, США), после чего была выполнена изоляция РНК в соответствии с протоколом производителя. После изоляции РНК было измерено соотношение A260/A280 для проверки загрязнения фенолом или белком. Затем из этой РНК была синтезирована кДКН с помощью набора обратной транскрипции QuantiTect® («Куиаген», Торонто, Канада) в соответствии с протоколом производителя. кДНК была использована в качестве шаблона для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) в реальном времени, проведенной с помощью системы реактивов Fermentas Maxima® SYBR Green («Термо Фишер Сайентифик», Оттава, Канада) в соответствии с протоколом производителя. Были выполнены амплификации на термоциклере MJ Mini, оборудованном модулем флуоресцентной детекции Bio-Rad MiniOpticon. Параметры цикла ПЦР составили: 95 °C в течение 15 с, 65,8 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с. Были проанализированы уровни экспрессии четырех типов транскриптов: мРНК с кодом для коллагена типа I (col1α1), коллагена типа II, аггрекана и глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ) в качестве референсного гена. Последовательности всех праймеров, использованных для ПЦР, описаны в таблице 1.
Остеоартроз яввляется болезненным дегенеративным заболеванием суставов, которое могло бы лучше поддаваться лечению, если технологами тканевой инженерии были бы разработаны методы создания долговечных заменителей тканей суставных хрящей методом тканевой инженерии. Многим существующим в настоящее время тканеинженерным моделям хрящей не достает химических раздражителей и благоприятной для клеток среды, чтобы способствовать накоплению матрикса и количественному росту клеток, что является необходимым при восстановлении суставного хряща. Целью данного исследования являлась проверка эффективности использования фибрин-альгинатного гидрогеля, содержащего гиалуроновую кислоту (ГК) и/или добавки хондроитин сульфата (ХС), для выращивания хондроцитов. Хондроциты новорожденных свиней, выращенные в фибрин-альгинатном гидрогеле, сохраняли свой фенотип лучше, чем хондроциты, выращенные в монослое, что подтверждается результатами анализа уровня их экспрессии при сравнении мРНК копий коллагенов типа II и типа I. Добавление ГК и ХС в гидрогели обеспечило увеличение выработки гликозаминогликана (ГАГ) матрикса в течение первой недели выращивания. Тем не менее, воздействие данных добавок на накопление матрикса не было совокупным и не наблюдалось по истечении двух недель выращивания. Добавление в гидрогели ХС или комбинации ХС и ГК привело к увеличению популяции клеток хондроцитов после двух недель выращивания. Результаты статистического анализа показали, что воздействие ГК и ХС на количество хондроцитов может быть совокупным. В данном исследовании выдвигается предположение, что добавление ХС и/или ГК оказывает положительное влияние на синтез хрящевого матрикса и количественный рост хондроцитов в трехмерных (3D) фибрин-альгинатных гидрогелях. Ключевые слова: остеоартроз, гиалуроновая кислота (ГК), гидрогель, тканевая инженерия
1. Введение Остеоартроз представляет собой термин, описывающий эрозию или разрушение суставного хряща, что, ввиду неспособности хряща к естественной самостоятельной регенерации, вызывает серьезные проблемы со здоровьем у людей во всем мире. Тканевая инженерия хрящевой ткани является дисциплиной, направленной на восстановление поражений хрящевой ткани при помощи искусственных хрящевых структур. Данные структуры состоят из биосовместимой трехмерной (3D) культурной среды, засеянной в суспензии с хондроцитами или мезенхимальными хондропрогениторными клетками. Данная культурная среда обеспечивает первоначальную механическую поддержку клеток, а также наличие микросреды, стимулирующей количественный рост клеток, а также поддержание или приобретение обособленного фенотипа хондроцита. Тем не менее, данная искусственная хрящевая структура зачастую обладает более низким уровнем внеклеточного матрикса по сравнению с натуральным хрящом. Это является серьезной проблемой тканеинженерных хрящей, так как механические свойства нового хряща и его интеграция в собственный хрящ пациента зависят от уровня выделения внеклеточного матрикса.
В настоящее время исследуются несколько различных методов увеличения накопления матрикса. Например, было продемонстрировано, что тип 3D-культурной среды влияет на накопление матрикса: в среде, содержащей гидрогели, выше уровень накопления внеклеточного матрикса и количественного роста клеток по сравнению с твердыми скаффолдами . Было продемонстрировано, что альгинатный гидрогель улучшает удержание фенотипа в хондроцитах по сравнению с традиционной монослойной культурой, а при добавлении фибрина в альгинат улучшается адгезия и количественный рост хондроцитов. Тем не менее, несмотря на то, что смешанный фибрин-альгинатный гидрогель показал лучшие результаты, чем альгинатный, к настоящему времени не проводился непосредственный сравнительный анализ удержания хондрогенного фенотипа в данном смешанном гидрогеле, а также в свежевыделенных хондроцитах или хондроцитах, выращенных в монослое. Другим методом стимулирования синтеза внеклеточного матрикса в тканеинженерных хрящевых структурах является добавление в гидрогель и культурную среду макромолекул, улучшающих показатели удержания их фенотипа. Примером данных молекул является растворенная форма естественных компонентов внеклеточного матрикса, таких как гиалуроновая кислота (ГА) и хондроитин сульфата (ХС). Оба исследования, проведенные Акмалом и др. и Кавасаки и др., продемонстрировали лучшее накопление сульфатированного гликозаминогликана (ГАГ), а также количественный рост хондроцитов в культурах, содержащих гидрогель с добавками ГК, по отношению к контрольным образцам гидрогеля без добавок. Таким же образом, при добавлении ХС также наблюдалось увеличение синтеза ГАГ и количественный рост клеток в 3D-культурах хондроцитов. Целью данного исследования является характеризация воздействия добавления ГК и ХС на синтез внеклеточного матрикса, количественный рост хондроцитов и экспрессию специфических генов хряща в 3D-культурной среде с фибрин-альгинатным гидрогелем, а также определение того, являются ли данные воздействия совокупными.
2. Материалы и методы
2.1. Изоляция хондроцитов
Суставной хрящ был выращен из бедренных и плечевых головок, задних и средних суставных выступов и коленных чашечек новорожденных свиней. Подопытные свиньи были предоставлены компанией «Прери Свайн Сентер» (Саскатун, Саскачеван, Канада); они умерли естественной смертью не более чем за 24 часа до диссекции. Хрящ был измельчен на фрагменты 1-2 мм при помощи сита и подвергнут последующему расщеплению, во время которого ткань выдерживалась 1 час (при температуре 37 °C в среде 5% CO 2 , при ОВ 100 %) с 10 мг/мл проназы («Берингер»/«Роче», Миссиссога, Канада) в среде Игла, модифицированной по методу Дульбекко, (DMEM) («Сигма-Аддрич», Оквилл, Канада) с добавлением 0,292 мг/мл глютамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б, 100 мкг/мл канамицина (GAK), а затем обработан 2 мг/мл коллагеназы (тип IA, «Сигма-Алдрич») в DMEM с добавлением 10 % сыворотки крови эмбрионов коров и GA, выдерживался 4 часа при температуре 37 °C и периодически перемешивался. Полученное в результате расщепленное вещество было пропущено через фильтр Nitex с размером пор 100 мкм, а изолированные хондрокситы были выделены посредством центрифугирования (10 минут, 300 g) и заново смешаны с DMEM/10 % сывороткой крови эмбрионов коров/GAK. Плотность клеток была определена с использованием гемоцитометра и отрегулирована до значения 5 × 10 7 клеток на мл.
2.2. Подготовка гидрогеля и засеивание хондроцитов
Альгинат («Сигма-Алдрич») и фибриноген («Сигма-Алдрич») были растворены в 150 мМ NaCl и 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) до базовой концентрации 30 мг/мл альгината и 62,5 мг/мл фибриногена, а затем стерилизованы посредством фильтрации. Затем базовый раствор альгината в количестве 30 мг/мл смешивался либо с 0,25 мг/мл ГК (из петушиного гребня; «Сигма-Алдрич»), либо с 0,25 мг/мл ХС (ХС-A коровьей трахеи; «Сигма-Алдрич»), либо с 0,25 мг/мл ГК + 0,25 мг/мл ХС, либо ни с одной из добавок. Одинаковые аликвоты фибриногена и базового раствора альгината с добавками были объединены и распределены на 157 мкл аликвоты в стерильные микротрубки объемом 1,5 мл. Затем 19,6 мкл суспензии клеток хондроцитов (5 × 10 7 клеток на мл) были повторно суспендированы в фибриногенную/альгинатную смесь в каждой трубке. Затем в каждую трубку было добавлено по 19 6 мкл раствора тромбина 100 ед/мл («Сигма-Алдрич»), после чего трубки выдерживались в течение 15 минут при температуре 37 °C для ускорения расщепления молекул фибриногена и образования фибринового геля. Получившийся в результате гель был покрыт 588 мкл 102 мМ CaCl2 и выдерживался 20 минут при температуре 37 °C для сшивания альгината. В результате этого было получено 194 мкл гидрогеля, окончательная концентрация компонентов в котором составила 25 мг/мл фибриногена, 12 мг/мл альгината, 5 × 10 6 клеток/мл, 10 ед/мл тромбина, а окончательная концентрация добавок составила 0,1 мг/мл ГК и/или 0,1 мг/или 0,1 мг/мл ХС. Полимеризованные пробки из гидрогеля были помещены в отдельные лунки 12-луночных планшетов для тканевых культур NUNC® (диаметр лунки - 2,1 см, «Термо Фишер Сайентифик», Оттава, Канада) и погружены в 2 мл среды DMEM/10 % сыворотки крови эмбрионов коров/GAK с добавлением либо 0,1 мг/мл ГК, либо 0,1 мг/мл ХС, либо 0,1 мг/мл ГК +0,1 мг/мл ХС (ГКХС), либо без добавок. Концентрация 0,1 мг/мл ГК, использованная в проведенных экспериментах, способствовала синтезу матрикса и количественному росту клеток в 3D хондроцитовых культурах [10,11], при этом добавление 0,1 мг/мл ХС обеспечивало увеличение роста матрикса [12].
2.3. Забор гидрогелей
Был проведен факторный эксперимент с участием группы проб гидрогелей (n = 8 для каждой группы дополнений), отобранной по истечении одной недели нахождения в культуре, другой группы, отобранной спустя две недели (n = 6 для каждой обработки), а также пяти гидрогелей без добавок, отобранных непосредственно в начале эксперимента (0 дней). Средний сырой вес гидрогелей через неделю нахождения в культуре составил 123 мг (± стандартное отклонение 15,6) и значительно не отличался для различных экспериментальных групп. Отобранные гидрогели были промыты в солевом растворе Хенкса в течение 10 минут, после чего они выдерживались при температуре 37 °C с 471 мкл раствора для растворения гидрогеля (90 мМ NaCl, 55 мМ цитрата натрия, 30мМ ЭДТА, 0.1 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0.2 мМ CaCl 2 , 0,2 мг/мл протеиназы K («Инвитроджен Лайф Текнолоджиз», Берлингтон, Канада) до полного растворения гелей. Была взята аликвота получившейся пробы 30,4 мкл, впоследствии смешанная с 70,6 мкл воды тройной дистилляции и удерживаемая при температуре 4 °C в целях последующего использования для количественной оценки сульфатированного ГАГ согласно описанию ниже. Оставшаяся проба гидрогеля была центрифугирована (5 мин, 4 °C, 300 g), надосадочная жидкость была удалена, а гранулированные клетки были вновь смешаны со 100 мкл солевого раствора Хенкса. Аликвота данной суспензии клеток в количестве 10 мкл была смешана со 160 мл солевого раствора Хенкса и заморожена для количественного определения ДНК при помощи красителей Хехст (n = 5, базовые гидрогели без добавок; n = 7, для недели 1; и n = 5, для недели 2 для каждой из четырех исследуемых групп). В пробах для недели 1 оставшиеся 100 мкл суспензии клеток были смешаны с 300 мл реактива TRIzol® LS («Инвитроджен Лайф Текнолоджиз»). Клетки были лизированы путем многократной аспирации через иглу для шприца 27 калибра, а затем заморожены при -80 °C для последующего анализа РНК. По одной пробе гидрогеля из каждой исследуемой группы для периодов времени 1 и 2 недели были использованы для гистологического разделения и окрашивания. Гидрогели были промыты в солевом растворе Хенкса, а затем помещены в раствор формальдегида (3,7 % формальдегида в фосфатно-буферном солевом растворе с добавлением Mg2+и Ca2+) на 30 минут для фиксирования клеток. Фиксированные пробы гидрогеля в течение ночи вымачивались в растворе сахарозы для криоконсервирования (30 % сахарозы в фосфатно- буферном солевом растворе с добавлением Mg2+и Ca2+), после чего были внедрены в смесь для заливки и замораживания срезов (Tissue-Tek) и заморожены при -80 °C до криостатитеского разделения и иммуноцитохимического окрашивания (см. раздел 2.7).
2.4. Анализ сульфатированного ГАГ
Некоторые пробы гидрогеля (n = 7 для однонедельных культур; n = 5 для двухнедельных культур каждой исследуемой группы) были использованы для проведения биохимического анализа общего содержания сульфатированного ГАГ. Результаты количественного определения при помощи 1,9-диметил-метиленового синего, использованные для при выполнении анализа сульфатированного ГАГ, были заимствованы из различных протоколов, найденных в литературных источниках [10,14,15,16], и модифицированы для применения с альгинатом посредством регулирования уровня pH красителя до 1.5. Другими словами, 21 мг диметил-метиленового синего («Сигма-Алдрич») были растворены в 5 мл абсолютного этанола. Затем было добавлено 2 г формиата натрия, и полученный раствор был смешан с 800 мл воды тройной дистилляции. В раствор была добавлена муравьиная кислота (95 %, «Сигма-Алдрич») до достижения уровня pH раствора 1,5, а также была добавлена дистиллированная вода до окончательного объема 1 л. Был создан набор стандартных образцов ГАГ постредством смешивания засеянных фибрин-альгинатных гидрогелей (согласно разделу 2.2), в которые были добавлены известные количества ХС (с окончательной концентрацией 0–100 мкг/мл). Аликвота разбавленной пробы гидрогеля 48 мкл (см. раздел 2.3) была добавлена к 300 мкл красителя диметил-метиленового синего и выдерживалась при комнатной температуре в течение одного часа. После этого пробы и стандарты были центрифугированы (15 мин, 16 °C, 11 500 g), и по 280 мкл каждой надосадочной жидкости были помещены при помощи пипетки в планшеты на 96 лунок. Данные о поглощении считывались при 600 нм с использованием спектрофотометрического планшет-ридера (SLT Spectra; «Текан», Моррисвилл, Северная Дакота, США). Был проведен контрольный эксперимент для подтверждения того, что экзогенный ХС, внесенный в гидрогели с добавлением ХС, не создавал фонового сигнала помехи при количественном определении с помощью диметил-метиленового синего при накоплении сульфатированного ГАГ. Значительных различий в первоначальных данных поглощения диметил-метиленового синего, полученных с использованием гидрогелей с добавками ХС, относительно гидрогелей без добавок (данные не показаны) обнаружено не было. Таким образом, было подверждено, что количество растворенных экзогенных ХС, оставшихся в гидрогелях после промывания в солевом растворе Хенкса в течение 10 минут (см. раздел 2.3) было недостаточным для того, чтобы создать помехи при количественном определении с использованием диметил-метиленового синего при накоплении сульфатированного ГАГ.
2.5. Количественное определение ДНК
Некоторые пробы были подвержены количественному флуориметрическому определению ДНК с помощью модифицированного метода Лабарка и др. [17]. Клетки были высвобождены из растворенных гидрогелей (см. раздел 2.3) и разрушены ультразвуком. 70 мкл аликвота клеток, разрушенных ультразвуком, была смешана с 30 мкл 4 мкг/мл красителя Хехст 33258 («Сигма-Алдрич») и 100 мкл 2х буфера (0,1 M NaH 2 PO 4 , 4 M NaCl, pH 7,4). Затем пробы были загружены в черный микротитрационный планшет на 96 лунок и было определено свечение с помощью планшет-ридера Fluorolite 1000 («Дайнекс Текнолоджиз», Уэртинг, Великобритания) при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны излучения 458 нм. Были проверены пробы набора ДНК стандартов (0–4 мкг/100 мкл, ДНК курицы) на абсолютное количественное определение содержания ДНК.
2.6. Анализ РНК методом количественной ПЦР в реальном времени (qPCR)
Клетки, высвобожденные из растворенных гидрогелей, были лизированы в реактиве TRIzol® LS как описано в разделе 2.3. Лизат был центрифугирован (10 мин, 12 000 g, 4 °C) для осаждения всех нерастворимых посторонних частиц. Надосадочная жидкость была смешана с 80 мкл хлороформа, выдерживалась при комнатной температуре в течение 5 минут, затем была центрифугирована (15 мин, 12 000 g, 4 °C) для отделения водных и органических фаз. Верхняя водная фаза была снята и смешана с 70 % этанолом в равном объеме. Этот раствор был затем добавлен в РНК колонну HiBind из набора E.Z.N.A™ Total RNA («Омега», «БиоТек», Норкросс, Джорджия, США), после чего была выполнена изоляция РНК в соответствии с протоколом производителя. После изоляции РНК было измерено соотношение A260/A280 для проверки загрязнения фенолом или белком. Затем из этой РНК была синтезирована кДКН с помощью набора обратной транскрипции QuantiTect® («Куиаген», Торонто, Канада) в соответствии с протоколом производителя. кДНК была использована в качестве шаблона для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) в реальном времени, проведенной с помощью системы реактивов Fermentas Maxima® SYBR Green («Термо Фишер Сайентифик», Оттава, Канада) в соответствии с протоколом производителя. Были выполнены амплификации на термоциклере MJ Mini, оборудованном модулем флуоресцентной детекции Bio-Rad MiniOpticon. Параметры цикла ПЦР составили: 95 °C в течение 15 с, 65,8 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с. Были проанализированы уровни экспрессии четырех типов транскриптов: мРНК с кодом для коллагена типа I (col1α1), коллагена типа II, аггрекана и глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ) в качестве референсного гена. Последовательности всех праймеров, использованных для ПЦР, описаны в таблице 1.
Для каждого гена был создан температурный градиент и выполнено последовательное разбавление, чтобы определить оптимальный температурный интервал отжига для ПЦР и эффективность амплификации ПЦР соответственно. Для того, чтобы убедиться, что каждая пара праймеров амплифицировала только специфическую целевую последовательность гена, были проведены гель-электрофорезный анализ и анализ кривой плавления продуктов ПЦР. Контрольные образцы без добавления матрицы ДНК (NTC; например,, смеси для ПЦР без матрицы кДНК) были использованы параллельно с пробами для проверки амплификации прамер-даймеров или загрязнения реактивов. Кроме того, случайным образом были выбраны 6 проб в качестве контрольных проб без обратной транскриптазы (NRT) для проверки загрязнения геномной ДНК в изолированных РНК. Как для NTC, так и для NRT, если амплификация имела место более чем через пять циклов после наименее выраженного транскрипта в экспериментальных пробах, эти данные не принимались в расчет в соответствии с рекомендациями Бастина и др. [18]. Наконец, 6 случайным образом выбранных проб были проанализированы на микрожидкостной системе для электрофореза Bio-Rad Experion, чтобы удостовериться в целостности вводимой РКН для синтеза кДНК и амплификации количественной ПЦР.
2.7. Иммуноокрашивание
Была проведена криогенная нарезка репрезентативных гидрогелей с помощью криостата HM550 («Термо Фишер Сайентифик», Оттава, Канада) на толщину 30 мкм. Нарезанные образцы поверглись иммуноокрашиванию для определения присутствия коллагена типа I и
II. Сначала нарезанные образцы были дважды промыты в фосфатно-буферном солевом растворе, содержащем 0,01 % фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБТ), каждая промывка длилась по 5 минут. Затем нарезанные образцы выдерживались в блокирующем растворе ФСБТ, содержащем 5 % сыворотки крови овец («Сигма-Алдрич»), в течение одного часа. Блокирующий раствор был заменен на разбавленное первичное антитело, в котором образцы выдерживались при комнатной температуре в течение одного часа. Раствор первичного антитела для коллагена типа II (гибридома - надосадочная жидкость II-II6B3; банк гибридом для исследований развития, Айова-Сити, Айова, США) был разбавлен в пропорции 1:25 с ФСБТ, содержащем 5 % сыворотки крови овец, а для моноклонального антитела коллагена типа I (каталог № 2456, «Сигма-Алдрич») - разбавлен в пропорции 1:200. После обработки первичного антитела нарезанные образцы были промыты четыре раза в ФСБТ (каждая промывка длилась по 10 минут). Затем нарезанные образцы выдерживались в течение одного часа при комнатной температуре в растворе вторичного антитела - козьих иммуноглобулинов, коньюгированных со щелочной фосфатазой анти-мышиные (400 мкг/мл; «Санта Круз Биотекнолоджи», Даллас, Техас, США) и ФСБТ, содержащего 5 % сыворотки крови овец в соотношении 1:200. Затем нарезанные образцы были трижды промыты с ФСБТ, содержащем 0,5 мг/мл левамизола (каждая промывка длилась по 10 минут), а затем дважды промыты в 100 мМ трис-HCl, pH 9.5, 50 мМ MgCl 2 , 100 мМ NaCl, 1 мг/мл Triton X-100, 0,5 мг/мл левамизола (NTMT). В завершении нарезанные образцы выдерживались в течение ночи при комнатной температуре в растворе для проявления цвета (NTMT с добавлением 0,34 мг/мл нитросинего тетразолия хлорида и 0,175 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3- индолилфосфата). Реакция проявления цвета была остановлена тремя пятиминутными промывками в ФСБТ. Отрицательная контрольная проба обрабатывалась параллельно таким же образом, как описано выше, но был исключен этап инкубации с первичным антителом.
2.8. Статистика
Как при количественном определении с помощью диметил-метиленового синего, так и при количественном определении красителем Хехст линейная модель с гидрогелями без добавок в качестве интерсепта была использована для определения статистического взаимодействия между применениями ГК и ХС, что могло дать взаимодополняющий, взаимно усиливающий или антагонистический биологический эффект. Кроме того, это позволило объединить в статистическом анализе гели, которые были изготовлены в эквивалентные моменты времени после смешивания компонентов, чтобы лучше выявить существенные различия между гидрогелями без добавок и гелями с добавками ГК, ХС и ГКХС. Дисперсионный анализ (ANOVA), а также ретроспективный анализ с HSD-критерием Тьюки были использованы для определения изменений в общей клеточной ДНК в культурах гидрогелей без добавок в течение двухнедельного периода выращивания. Все параметрические тесты, указанные выше, были проведены с помощью программного обеспечения R© (версия 2.10.1) [19]. Программаное средство Relative Expression (REST) [20] использовалось для непараметрического анализа данных количественной ПЦР по уровням транскриптов коллагена I, коллагена II, аггрекана и ГАФДГ в культурах гидрогелей, монослойных культурах и в свежевыделенных хондроцитах.
3. Результаты
Количественное определение ГАГ с помощью диметил-метиленового синего было использовано для количественного подсчета синтеза матрикса (определяется по уровням сульфатированного ГАГ) в культурах гидрогелей с добавлением ХС, ГК и ГКХС относительно культур гидрогелей без добавок. Данное количественное определение (рисунок 1) показало значительно более высокие уровни аккумуляции сульфатированного ГАГ в гидрогелях с добавками ХС, ГК и ГКХС относительно культур гидрогелей без добавок после одной недели выращивания, при этом не было значительных различий в количестве сульфатированного ГАГ после двух недель выращивания. Влияние применения ГК и ХС на синтез ГАГ не было совокупным, так как в гидрогелях, в которые была добавлена комбинация ГА и ХС (ГКХС), аккумулирование сульфатированного ГАГ было не выше, чем при использовании ГК и ХС по отдельности (рисунок 1). Это было подтверждено статистическим анализом с применением линейных моделей со смешанными эффектами.
2.7. Иммуноокрашивание
Была проведена криогенная нарезка репрезентативных гидрогелей с помощью криостата HM550 («Термо Фишер Сайентифик», Оттава, Канада) на толщину 30 мкм. Нарезанные образцы поверглись иммуноокрашиванию для определения присутствия коллагена типа I и
II. Сначала нарезанные образцы были дважды промыты в фосфатно-буферном солевом растворе, содержащем 0,01 % фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБТ), каждая промывка длилась по 5 минут. Затем нарезанные образцы выдерживались в блокирующем растворе ФСБТ, содержащем 5 % сыворотки крови овец («Сигма-Алдрич»), в течение одного часа. Блокирующий раствор был заменен на разбавленное первичное антитело, в котором образцы выдерживались при комнатной температуре в течение одного часа. Раствор первичного антитела для коллагена типа II (гибридома - надосадочная жидкость II-II6B3; банк гибридом для исследований развития, Айова-Сити, Айова, США) был разбавлен в пропорции 1:25 с ФСБТ, содержащем 5 % сыворотки крови овец, а для моноклонального антитела коллагена типа I (каталог № 2456, «Сигма-Алдрич») - разбавлен в пропорции 1:200. После обработки первичного антитела нарезанные образцы были промыты четыре раза в ФСБТ (каждая промывка длилась по 10 минут). Затем нарезанные образцы выдерживались в течение одного часа при комнатной температуре в растворе вторичного антитела - козьих иммуноглобулинов, коньюгированных со щелочной фосфатазой анти-мышиные (400 мкг/мл; «Санта Круз Биотекнолоджи», Даллас, Техас, США) и ФСБТ, содержащего 5 % сыворотки крови овец в соотношении 1:200. Затем нарезанные образцы были трижды промыты с ФСБТ, содержащем 0,5 мг/мл левамизола (каждая промывка длилась по 10 минут), а затем дважды промыты в 100 мМ трис-HCl, pH 9.5, 50 мМ MgCl 2 , 100 мМ NaCl, 1 мг/мл Triton X-100, 0,5 мг/мл левамизола (NTMT). В завершении нарезанные образцы выдерживались в течение ночи при комнатной температуре в растворе для проявления цвета (NTMT с добавлением 0,34 мг/мл нитросинего тетразолия хлорида и 0,175 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3- индолилфосфата). Реакция проявления цвета была остановлена тремя пятиминутными промывками в ФСБТ. Отрицательная контрольная проба обрабатывалась параллельно таким же образом, как описано выше, но был исключен этап инкубации с первичным антителом.
2.8. Статистика
Как при количественном определении с помощью диметил-метиленового синего, так и при количественном определении красителем Хехст линейная модель с гидрогелями без добавок в качестве интерсепта была использована для определения статистического взаимодействия между применениями ГК и ХС, что могло дать взаимодополняющий, взаимно усиливающий или антагонистический биологический эффект. Кроме того, это позволило объединить в статистическом анализе гели, которые были изготовлены в эквивалентные моменты времени после смешивания компонентов, чтобы лучше выявить существенные различия между гидрогелями без добавок и гелями с добавками ГК, ХС и ГКХС. Дисперсионный анализ (ANOVA), а также ретроспективный анализ с HSD-критерием Тьюки были использованы для определения изменений в общей клеточной ДНК в культурах гидрогелей без добавок в течение двухнедельного периода выращивания. Все параметрические тесты, указанные выше, были проведены с помощью программного обеспечения R© (версия 2.10.1) [19]. Программаное средство Relative Expression (REST) [20] использовалось для непараметрического анализа данных количественной ПЦР по уровням транскриптов коллагена I, коллагена II, аггрекана и ГАФДГ в культурах гидрогелей, монослойных культурах и в свежевыделенных хондроцитах.
3. Результаты
Количественное определение ГАГ с помощью диметил-метиленового синего было использовано для количественного подсчета синтеза матрикса (определяется по уровням сульфатированного ГАГ) в культурах гидрогелей с добавлением ХС, ГК и ГКХС относительно культур гидрогелей без добавок. Данное количественное определение (рисунок 1) показало значительно более высокие уровни аккумуляции сульфатированного ГАГ в гидрогелях с добавками ХС, ГК и ГКХС относительно культур гидрогелей без добавок после одной недели выращивания, при этом не было значительных различий в количестве сульфатированного ГАГ после двух недель выращивания. Влияние применения ГК и ХС на синтез ГАГ не было совокупным, так как в гидрогелях, в которые была добавлена комбинация ГА и ХС (ГКХС), аккумулирование сульфатированного ГАГ было не выше, чем при использовании ГК и ХС по отдельности (рисунок 1). Это было подтверждено статистическим анализом с применением линейных моделей со смешанными эффектами.
Влияние добавления гиалуроновой кислоты (ГК), хондроитин сульфата (ХС) или совместного добавления гиалуроновой кислоты и хондроитин сульфата (ГКХС) на уровень синтеза сульфатированного гликозаминогликана (ГАГ) в фибрин-альгинатных гидрогелях,
выращиваемых в течение одной недели (n = 7 для каждой обработки) и двух недель (n = 5 для каждой обработки). В необработанные культуры гидрогелей не добавлялись ни ГК ни ХС. Высота столбцов показывает среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. Звездочками показаны значения, которые значительно отличаются от значений для необработанных культур гидрогелей (** p < 0,01; * p < 0,05). Количественное определение ДНК красителем Хехста было использовано для количественного подсчета относительного количества клеток в культурах гидрогелей. В гидрогелях без добавок наблюдался приблизительно двукратный рост общего количества клеточной ДНК во время первой недели выращивания, но популяция клеток больше не увеличилась во время второй недели выращивания (рисунок 2). После одной недели выращивания в гидрогелях с добавлением ГК, ХС и ГКХС наблюдалось немного меньшее среднее количество клеточной ДНК, чем в гидрогелях без добавок, хотя снижение было незначительным. Наоборот, через две недели выращивания гидрогели с добавлением ГК, ХС и ГКХС наблюдалось немного большее среднее количество клеточной ДНК относительно контрольных проб без добавок. Статистический анализ с использованием линейной модели со смешанными эффектами, который позволил провести статистическое парное сравнение культур гидрогелей, изготовленных в одно и то же время, показал, что увеличение уровней клеточной ДНК было значительным в гидрогелях с добавлением ХС и ГКХС по сравнению с контрольными гидрогелями без добавок. Более того, в соответствии со статистическим анализом с использованием линейной модели со смешанными эффектами предполагается, что добавление ГК и ХС имеет совокупный эффект на аккумуляцию клеток ДНК в двухнедельных культурах гидрогелей.
выращиваемых в течение одной недели (n = 7 для каждой обработки) и двух недель (n = 5 для каждой обработки). В необработанные культуры гидрогелей не добавлялись ни ГК ни ХС. Высота столбцов показывает среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. Звездочками показаны значения, которые значительно отличаются от значений для необработанных культур гидрогелей (** p < 0,01; * p < 0,05). Количественное определение ДНК красителем Хехста было использовано для количественного подсчета относительного количества клеток в культурах гидрогелей. В гидрогелях без добавок наблюдался приблизительно двукратный рост общего количества клеточной ДНК во время первой недели выращивания, но популяция клеток больше не увеличилась во время второй недели выращивания (рисунок 2). После одной недели выращивания в гидрогелях с добавлением ГК, ХС и ГКХС наблюдалось немного меньшее среднее количество клеточной ДНК, чем в гидрогелях без добавок, хотя снижение было незначительным. Наоборот, через две недели выращивания гидрогели с добавлением ГК, ХС и ГКХС наблюдалось немного большее среднее количество клеточной ДНК относительно контрольных проб без добавок. Статистический анализ с использованием линейной модели со смешанными эффектами, который позволил провести статистическое парное сравнение культур гидрогелей, изготовленных в одно и то же время, показал, что увеличение уровней клеточной ДНК было значительным в гидрогелях с добавлением ХС и ГКХС по сравнению с контрольными гидрогелями без добавок. Более того, в соответствии со статистическим анализом с использованием линейной модели со смешанными эффектами предполагается, что добавление ГК и ХС имеет совокупный эффект на аккумуляцию клеток ДНК в двухнедельных культурах гидрогелей.
Влияние добавления ГК, ХС и ГКХС на общие уровни клеточного ДНК (индикатор относительного количества хондроцита) в фибрин-альгинатных гидрогелях, выращиваемых в течение одной недели (n = 7 для каждой обработки) и двух недель (n = 5 для каждой обработки) или собранных немедленно после засеивания клеток (n = 5). В необработанные гидрогели не добавлялись ни ГК ни ХС. Столбцы ошибок показывают стандартное отклонение от среднего значения. Звездочками показано значительное увеличение общих уровней клеточного ДНК в необработанных гидрогелях после одной и двух недель выращивания по сравнению с началом выращивания (0 дней) (** p < 0,01). Количественная ПЦР в реальном времени была использована для определения уровней экспрессии мРНК с кодом для коллагена типа I (col1α1), коллагена типа II (col2α1), аггрекана и ГАФДГ. Уровни транскриптов коллагена I, коллагена II и аггрекана в гидрогелях с добавлением ГК, ХС и ГКХС были нормализованы относительно уровней мРНК для конститутивно экспрессируемого референсного гена ГАФДГ и выражены как соотношение экспрессии соответствующего целевого гена в контрольных гидрогелях без добавок (рисунок 3). Статистический анализ данных количественной ПЦР с помощью ПО REST на выявил значительного увеличения или снижения экспрессии генов коллагена I, коллагена II или
аггрекана при сравнении трех различных вариантов гидрогелей с добавками и необработанной контрольной группы.
аггрекана при сравнении трех различных вариантов гидрогелей с добавками и необработанной контрольной группы.
На графиках показаны относительные уровни эксперссии (R) мРНК с кодом для (a) коллагена типа I, (b) коллагена типа II и (c) аггрекана в гидрогелях с добавлением ХС (n = 7), ГК (n = 6) и ГКХС (n = 7), выраженные как соотношения соответствующих уровней мРНК в гидрогелях без добавок, для которых назначено значение параметра R равное единице. Высота баров указывает на среднее значение ± стандартное отклонение, рассчитанное при статистическом анализе с применением ПО Relative Expression Software Tool (REST). (Примечание. Показанные значения экспрессии генов коллагена I, коллагена II и аггрекана нормализованы относительно уровня мРНК для конститутивно экспрессируемого транскрипта ГАФДГ. Не было существенных различий в уровнях РНК ГАФДГ в группах гидрогелей с добавлением ГК, ХС, ГКХС и без добавления (данные не показаны)). Репрезентативные культуры гидрогелей из групп с добавлением ГК, ХС, ГКХС и без добавления были разрезаны с помощью криостата и иммуноцитохимически окрашены антителами, специфическими для белков коллагена типа I, и коллагена типа II. Как показано на рисунке 4, и белки коллагена типа I, и белки коллагена типа II были обнаружены в гидрогелях из всех четырех групп на первой и на второй неделях выращивания. Это подтвердило, что мРНК коллагена I и II, обнаруженная при количественной ПЦР, действительно была преобразована в белок. Тем не менее, мы не смогли провести количественные сравнения относительного количества белков коллагена I или коллагена II между группами с различными добавками из-за изменчивости качества гистологических срезов различных проб гидрогелей, а также значительных различий в интенсивности окрашивания различных зон одной и той же пробы.
Иммуноокрашивание нарезанных образцов гидрогелей с добавлением ХС, ГК или ГКХС. Гидрогели без добавок (необработанные) были использованы в качестве контрольных проб. Окрашивание показало, что во всех исследуемых группах наблюдалось накопление белков коллагена типа I и коллагена типа II с течением времени. Все микрофотографии были сделаны при одинаковом увеличении с помощью составного микроскопа Leitz DM-RB (с линзой объектива с десятикратным увеличением), оборудованного камерой Sony DSC-V3. 4. Обсуждение Основной проблемой в инженерии искусственных хрящевых тканевых структур является разработка оптимизированной культурной среды, которая поддерживает выживаемость и количественный рост внедренных клеток хондроцитов, при этом также сохраняет фенотип хондроцитов и поддерживает биосинтез компонентов внеклеточного матрикса, специфичных для хряща. Результаты многих исследований показали, что количественный рост хондроцитов в монослойных культурах на стандартных чашках Петри приводит к их постепенной дедифференциации, что характеризуется переходом от синтеза коллагена II к синтезу коллагену I, снижению секреции аггрекана и появлению фибробластической морфологии [21]. Наоборот, внедрение хондроцитов в 3D гидрогели, состоящие из различных натуральных полимеров или синтетических полимеров, способствует поддержанию нормальных шаблонов экспрессии генов и секреции матрикса хряща [5,6,7,22]. Перка и др. [9] продемонстрировали преимущества скаффолд-системы фибрин-альгинатных гидрогелей, которая обеспечила лучшую среду для длительного выращивания хондроцитов, чем гидрогели, состоящие только из фибрина или альгината. На основании результатом этих более ранних отчетов мы наблюдали, что хондроциты новорожденных свиней, выращиваемые в монослойных культурах, демонстрировали прогрессирующее снижение экспрессии генов коллагена II и аггрекана в период выращивания 6-12 дней и соответствующее увеличение экспрессии коллагена I (дополнительный рисунок S1). Наоборот, хондроциты, выращиваемые в фибрин-альгинатном гидрогеле, демонстрировали значительно более высокое соотношение экспрессии мРНК коллагена II относительно коллагена I по сравнению с хондроцитами, выращенными в монослое (дополнительный рисунок S2). Целью настоящего исследования являлась проверка влияния дополнения фибрин- альгинатного гидрогеля экзогенными ГК и ХС на параметры роста популяции хондроцитов, синтез внеклеточного матрикса и экспрессию генов, специфичных для хряща. Более того, мы хотели определить, будет ли дополнение гидрогеля ГК и ХС в комбинации (ГКХС) иметь совокупное действие на данные показатели хондроцитов. Вы выявили, что добавление либо ХС, либо ГК, либо ГКХС увеличивало уровни синтеза сульфатированного ГАГ в хондроцитовых культурах в фибриновом/альгинатном гидрогеле. Это соответствует более ранним отчетам, в соответствии с которыми экзогенные ГК и ХС могут усилить синтез внеклеточного матрикса в культурах хондроцитов [10,11,13]. Интересно отметить, что стимулирующее действие ХС и ГК на накопление сульфатированного ГАГ, которое мы наблюдали, было заметно только в течение первой недели выращивания. Возможно, действие экзогенных ХС и ГК становится еле заметным через две редели выращивания из-за увеличения отложений недавно синтезированного аггрекана, эндогенного хондроитин сульфат протеогликана, специфичного для хряща, хондроцитами, внедренными в фибрин-альгинатный гидрогель. Предыдущее исследование, проведенное Сузанте и др. [13], показало, что синтез матрикса замедлялся с возрастающим накоплением ГАГ в хондроитин сульфат - коллаген I скаффолд-системе для выращивания хондроцитов. Вопреки имеющимся ожиданиям было выяснено, что стимулирующее действие добавления ХЧ и ГК на синтез сульфатированного ГАГ в фибрин-альгинатном гидрогеле не было совокупным. Возможно, концентрация добавок ХС и ГК равная 1 мг/мл, использованная в проведенных экспериментах, была достаточна сама по себе для максимального стимулирования синтеза ГАГ матрикса. Добавление только ХС или комбинации ХС и ГК также оказывало положительное влияние на рост популяции хондроцитов в фибрин-альгинатных гидрогелях. Через две недели выращивания гидрогели с добавлением ХС и ГКХС демонстрировали значительно более высокий общий уровень аккумуляции ДНК, чем гидрогели без добавок. Добавление только ГК не вызывало статистически значимого увеличения среднего уровня клеточного ДНК. Однако, добавление ГК в комбинации с ХС имело совокупное действие на количественный рост хондроцитов, который был более выраженным, чем при добавлении только ХС. Также следует отметить стимулирующее действие добавления ХС и ГКХС на рост популяции хондроцитов не наблюдалось в течение первой недели выращивания в гидрогеле. Похожие тенденции наблюдались в исследованиях, проведенных ван Сузанте и др. [13] и Акмалом и др. [10], которые отметили временную задержку воздействия добавления ГК и ХС на количественный рост выращиваемых хондроцитов. В рамках проведенного исследования также проводилась проверка того, влияет ли добавление ХС и/или ГК в фибрин-альгинатные гидрогели на уровни экспрессии транскриптов аггрекана, специфического для хряща, и коллагена II или уровень мРНК для коллагена I, маркера для дедифференцированных хондроцитов. Однако, данные количественной ПЦР не показали статистически значимого влияния добавления ХС, ГК или ГКХС на уровни экспрессии любого из этих целевых генов. Из этого можно сделать вывод, что стимулирующее действие добавления ХС и ГК на аккумулирование ГАГ могло быть вызвано каким-либо посттранскрипционным влиянием на эксперссию сульфатированных протеогликанов матрикса, таких как аггрекан. Полученным результатам также соответствуют результаты более ранних исследований Нишимото и др.[23]; в соответствии с ними добавление ХС и ГК с малой молекулярной массой не имеет значительного воздействия на уровни экспрессии транскриптов коллагена II и аггрекана в 3D системах выращивания хондроцитов. В соответствии с экспрессией транскриптов мРНК коллагена II и мРНК коллагена I в использованных культурах гидрогелей иммуноцитохимическое окрашивание подтвердило, что белки коллагенов типа II и типа I были внесены в фибрин-альгинатный гель. Как для коллагена II, так и для коллагена I иммуноокрашивание оказалось преимущественно околоклеточным. Таким образом, присутствие белков как коллагена II, так и коллагена I в фибрин-альгинатных гидрогелях указывает на то, что внесенные клетки могут быть смесью фенотипически различных хондроцитов, а также некоторых хондроцитов, подвергшихся дедифференциации. К сожалению, мы не смогли определить, добавление какого именно компонента (ХС, ГК или ГКХС) вызвало количественные изменения количества белков коллагена II или коллагена I из-за разницы в качестве гистологических срезов, полученных от разных проб гидрогелей, а также различной интенсивности иммуноокрашивания в различных зонах одного и того же образца. Текущее исследование имеет большое количество ограничений, которые должны быть приняты во внимание во время последующих исследований. Мы испытывали только одну концентрацию ХС и ГК (0,1мг/мл), добавляемую в использованные фибрин-альгинатные гидрогели, при этом оптимальное действие на показатели хондроцитов могло быть при более высоких или более низких дозах. Акмал и др. [10] продемонстрировали, что дозировка ГК влияет на аккумуляцию матрикса и количественный рост хондроцитов и, скорее всего, действие ХС и ГК в комбинации также зависит от дозировки. Более того, кроме ХС и ГК есть большое количество других макромолекул (например, коллаген II), которые могли быть проверены отдельно или в комбинации в качестве возможных дополнений для улучшения качества тканеинженерных хрящевых структур, а также стимулирование факторов роста растворимых веществ, например, костные морфогенетические белки (BMP) и трансформирующих ростовых факторов бета 1 (TGF-βs), которые увеличивают транскрипцию специфических хрящевых генов и синтез матрикса. В последующих исследованиях важно будет провести механические испытания [4] гидрогелей после длительного выращивания, чтобы определить влияние добавок на несущую способность структур. Разработка оптимизированных режимов внесения добавок в 3D культуры хондроцитов, которые эффективны для сохранения видоизмененного фенотипа хондроцита и синтеза внеклеточного матрикса со свойствами, похожими на свойства натурального хрящевого матрикса, является важной составляющей в инженерии имплантируемых заменителей хрящевых тканей, способных к функциональной интеграции с окружающими натуральными тканями. Следующим шагом является синтез искусственных хрящевых структур, которые имитируют зонную структуру натурального суставного хряща с неоднородными биологическими и механическими свойствами в зависимости от слоя [22, 24]. 5. Выводы Результаты исследования показали, что добавление ХС и ГК, как отдельно, так и в комбинации, увеличивает аккумуляцию ГАГ матрикса и количественный рост клеток хондроцитов, внесенных в 3D фибрин-альгинатные гидрогели. Стимулирующее действие ХС и ГК на рост количества хондроцитов было совокупным и стало очевидным через две недели выращивания in vitro. Наоборот, стимулирующее действие ХС и ГК на синтез сульфатированного ГАГ было несовокупным и было заметно только в течение первой недели выращивания. Важным фактором, который следует учитывать при разработке усовершенствованных скаффолд-систем для тканевой инженерии хрящевой ткани, является создание искусственной микросреды с оптимизированным макромолекулярным составом, который поддерживает видоизмененный фенотип внесенных хондроцитов и который ускоряет устойчивый биосинтез внеклеточного матрикса, характерного для хряща. Благодарности Авторы выражают признательность за финансовую поддержку Совету по естественнонаучным и инженерным исследованиям Канады (NSERC), выдавшему Уильяму М. Кулику научный грант, а также Фонду исследований в области здравоохранения провинции Саскачеван (SHRF), выдавшему Сюнбяо Чэну грант на проведение группового исследования в области здравоохранения (этап 2). Выражаем благодарность компании «Прери Свайн Сентер» за предоставление поросят.
Дополнительные файлы
Вклад авторов Кристофер Джей Литл, Уильям М. Кулик и Сюнбяо Чэн придумали и разработали экспериментоы; Кристофер Джей Литл провел все эксперименты; Кристофер Джей Литл и Уильям М. Кулик проанализировали данные; Уильям М. Кулик и Сюнбяо Чэн предоставили реактивы и материалы. Данную работу выполнил Кристофер Джей Литл, проверил Уильям М. Кулик. Конфликт интересов Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов. Использованные источники 1. Lawrence R.C., Felson D.T., Helmick C.G., Arnold L.M., Choi H., Deyo R.A., Gabriel S., Hirsch R., Hochberg M.C., Hunder G.G., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States part II. Arthritis Rheum. 2008;58:26–35. [PMC free article] [PubMed] 2. Woodfield T.B.F., van Blitterswijk C.A., de Wijn J., Sims T.J., Hollander A.P., Riesle J. Polymer scaffolds fabricated with pore-size gradients as a model for studying the zonal organization within tissue-engineered cartilage constructs. Tissue Eng. 2005;11:1297–1311. doi: 10.1089/ten.2005.11.1297.[PubMed] [Cross Ref] 3. Obradovic B., Martin I., Padera R.F., Treppo S., Freed L.E., Vunjak-Novakovic G. Integration of engineered cartilage. J. Orthop. Res. 2001;19:1089–1097. doi: 10.1016/S0736- 0266(01)00030-4.[PubMed] [Cross Ref] 4. Little C.J., Bawolin N.K., Chen X.B. Mechanical properties of natural cartilage and tissue engineered constructs. Tissue Eng. B Rev. 2011;17:213–227. doi: 10.1089/ten.teb.2010.0572. [PubMed] [Cross Ref] 5. Gong Y., He L., Li J., Zhou Q., Ma Z., Gao C., Shen J. Hydrogel-filled polylactide porous scaffolds for cartilage tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res. B. 2006;82:192–204. [PubMed] 6. Lee C.R., Grad S., Gorna K., Gogolewski S., Goessl A., Alini M. Fibrin-polyurethane composites for articular cartilage tissue engineering: A preliminary analysis. Tissue Eng. 2005;11:1562–1573. doi: 10.1089/ten.2005.11.1562. [PubMed] [Cross Ref] 7. Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes for tissue engineering in alginate beads enhances chondrocytic phenotype compared to conventional monolayer techniques. Acta Orthop. Scand. 2003;74:6–15. doi: 10.1080/00016470310013581. [PubMed] [Cross Ref] 8. Lindenhayn K., Perka C., Spitzer R., Heilmann H., Pommerening K., Mennicke J., Sittinger M. Retention of hyaluronic acid in alginate beads: Aspects for in vitro cartilage engineering. J. Biomed. Mater. Res. A. 1999;44:149–155. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(199902)44:2<149::AID- JBM4>3.0.CO;2-C.[PubMed] [Cross Ref]
9. Perka C., Spitzer R.S., Lindenhayn K., Sittinger M., Schultz O. Matrix-mixed culture: New methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants. J. Biomed. Mater. Res. A. 2000;49:305–311. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(20000305)49:3<305::AID- JBM2>3.0.CO;2-9. [PubMed] [Cross Ref] 10. Akmal M., Singh A., Anand A., Kesani A., Aslam N., Goodship A., Bentley G. The effects of hyaluronic acid on articular chondrocytes. Bone Joint J. 2005;87:1143–1149. doi: 10.1302/0301- 620X.87B8.15083. [PubMed] [Cross Ref] 11. Kawasaki K., Ochi M., Uchio Y., Adachi N., Matsusaki M. Hyaluronic acid enhances proliferation and chondroitin sulfate synthesis in cultured chondrocytes embedded in collagen gels. J. Cell. Physiol. 1999;179:142–148. doi: 10.1002/(SICI)1097-4652(199905)179:2<142::AID- JCP4>3.0.CO;2-Q. [PubMed][Cross Ref] 12. Bassleer C.T., Combal J.P., Bougaret S., Malaise M. Effects of chondroitin sulfate and interleukin-1 beta on human articular chondrocytes cultivated in clusters. Osteoarthr. Cartil. 1998;6:196–204. doi: 10.1053/joca.1998.0112. [PubMed] [Cross Ref] 13. Van Susante J.L.C., Pieper J., Buma P., van Kuppevelt T.H., van Beuningen H., van der Kraan P.M., Veerkamp J.H., van den Berg W.B., Veth R.P.H. Linkage of chondroitin-sulfate to type I collagen scaffolds stimulates the bioactivity of seeded chondrocytes in vitro. Biomaterials. 2001;22:2359–2369. doi: 10.1016/S0142-9612(00)00423-3. [PubMed] [Cross Ref] 14. Enobakhare B.O., Bader D.L., Lee D.A. Quantification of sulfated glycosaminoglycans in chondrocyte/alginate cultures, by use of 1,9-dimethylmethylene blue. Anal. Biochem. 1996;243:189–191. doi: 10.1006/abio.1996.0502. [PubMed] [Cross Ref] 15. Lee C.S.D., Gleghorn J.P., Won Choi N., Cabodi M., Stroock A.D., Bonassar L.J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 2007;28:2987–2993. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.02.035. [PubMed] [Cross Ref] 16. Williams G.M., Klein T.J., Sah R.L. Cell density alters matrix accumulation in two distinct fractions and the mechanical integrity of alginate-chondrocyte constructs. Acta Biomater. 2005;1:625–633. doi: 10.1016/j.actbio.2005.07.009. [PubMed] [Cross Ref] 17. Labarca C., Paigen K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biochem. 1980;102:344–352. doi: 10.1016/0003-2697(80)90165-7. [PubMed] [Cross Ref] 18. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 2009;55:611–622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.[PubMed] [Cross Ref] 19. R Development Core Team . R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria: 2009. 20. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2002;30 doi: 10.1093/nar/30.9.e36. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
21. Cheng T., Maddox N.C., Wong A.W., Rahnama R., Kuo A.C. Comparison of gene expression patterns in articular cartilage and dedifferentiated articular chondrocytes. J. Orthop. Res. 2012;30:234–245. doi: 10.1002/jor.21503. [PubMed] [Cross Ref] 22. Izadifar Z., Chen X., Kulyk W. Strategic design and fabrication of engineered scaffolds for articular cartilage repair. J. Funct. Biomater. 2012;3:799–838. doi: 10.3390/jfb3040799. [PMC free article][PubMed] [Cross Ref] 23. Nishimoto S., Takagi M., Wakitani S., Nihira T., Yoshida T. Effect of chondroitin sulfate and hyaluronic acid on gene expression in a three-dimensional culture of chondrocytes. J. Biosci. Bioeng. 2005;100:123–126. doi: 10.1263/jbb.100.123. [PubMed] [Cross Ref] 24. Nguyen L.H., Kudva A.K., Saxena N.S., Roy K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 2011;32:6946–6952. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.06.014. [PubMed][Cross Ref]
Статьи из Журнала функциональныз иоматериалов (Journal of Functional Biomaterials) предоставлены Институтом междисциплинарных цифровых публикаций (Multidisciplinary Digital Publishing Institute, MDPI)
Дополнительные файлы
Вклад авторов Кристофер Джей Литл, Уильям М. Кулик и Сюнбяо Чэн придумали и разработали экспериментоы; Кристофер Джей Литл провел все эксперименты; Кристофер Джей Литл и Уильям М. Кулик проанализировали данные; Уильям М. Кулик и Сюнбяо Чэн предоставили реактивы и материалы. Данную работу выполнил Кристофер Джей Литл, проверил Уильям М. Кулик. Конфликт интересов Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов. Использованные источники 1. Lawrence R.C., Felson D.T., Helmick C.G., Arnold L.M., Choi H., Deyo R.A., Gabriel S., Hirsch R., Hochberg M.C., Hunder G.G., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States part II. Arthritis Rheum. 2008;58:26–35. [PMC free article] [PubMed] 2. Woodfield T.B.F., van Blitterswijk C.A., de Wijn J., Sims T.J., Hollander A.P., Riesle J. Polymer scaffolds fabricated with pore-size gradients as a model for studying the zonal organization within tissue-engineered cartilage constructs. Tissue Eng. 2005;11:1297–1311. doi: 10.1089/ten.2005.11.1297.[PubMed] [Cross Ref] 3. Obradovic B., Martin I., Padera R.F., Treppo S., Freed L.E., Vunjak-Novakovic G. Integration of engineered cartilage. J. Orthop. Res. 2001;19:1089–1097. doi: 10.1016/S0736- 0266(01)00030-4.[PubMed] [Cross Ref] 4. Little C.J., Bawolin N.K., Chen X.B. Mechanical properties of natural cartilage and tissue engineered constructs. Tissue Eng. B Rev. 2011;17:213–227. doi: 10.1089/ten.teb.2010.0572. [PubMed] [Cross Ref] 5. Gong Y., He L., Li J., Zhou Q., Ma Z., Gao C., Shen J. Hydrogel-filled polylactide porous scaffolds for cartilage tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res. B. 2006;82:192–204. [PubMed] 6. Lee C.R., Grad S., Gorna K., Gogolewski S., Goessl A., Alini M. Fibrin-polyurethane composites for articular cartilage tissue engineering: A preliminary analysis. Tissue Eng. 2005;11:1562–1573. doi: 10.1089/ten.2005.11.1562. [PubMed] [Cross Ref] 7. Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes for tissue engineering in alginate beads enhances chondrocytic phenotype compared to conventional monolayer techniques. Acta Orthop. Scand. 2003;74:6–15. doi: 10.1080/00016470310013581. [PubMed] [Cross Ref] 8. Lindenhayn K., Perka C., Spitzer R., Heilmann H., Pommerening K., Mennicke J., Sittinger M. Retention of hyaluronic acid in alginate beads: Aspects for in vitro cartilage engineering. J. Biomed. Mater. Res. A. 1999;44:149–155. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(199902)44:2<149::AID- JBM4>3.0.CO;2-C.[PubMed] [Cross Ref]
9. Perka C., Spitzer R.S., Lindenhayn K., Sittinger M., Schultz O. Matrix-mixed culture: New methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants. J. Biomed. Mater. Res. A. 2000;49:305–311. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(20000305)49:3<305::AID- JBM2>3.0.CO;2-9. [PubMed] [Cross Ref] 10. Akmal M., Singh A., Anand A., Kesani A., Aslam N., Goodship A., Bentley G. The effects of hyaluronic acid on articular chondrocytes. Bone Joint J. 2005;87:1143–1149. doi: 10.1302/0301- 620X.87B8.15083. [PubMed] [Cross Ref] 11. Kawasaki K., Ochi M., Uchio Y., Adachi N., Matsusaki M. Hyaluronic acid enhances proliferation and chondroitin sulfate synthesis in cultured chondrocytes embedded in collagen gels. J. Cell. Physiol. 1999;179:142–148. doi: 10.1002/(SICI)1097-4652(199905)179:2<142::AID- JCP4>3.0.CO;2-Q. [PubMed][Cross Ref] 12. Bassleer C.T., Combal J.P., Bougaret S., Malaise M. Effects of chondroitin sulfate and interleukin-1 beta on human articular chondrocytes cultivated in clusters. Osteoarthr. Cartil. 1998;6:196–204. doi: 10.1053/joca.1998.0112. [PubMed] [Cross Ref] 13. Van Susante J.L.C., Pieper J., Buma P., van Kuppevelt T.H., van Beuningen H., van der Kraan P.M., Veerkamp J.H., van den Berg W.B., Veth R.P.H. Linkage of chondroitin-sulfate to type I collagen scaffolds stimulates the bioactivity of seeded chondrocytes in vitro. Biomaterials. 2001;22:2359–2369. doi: 10.1016/S0142-9612(00)00423-3. [PubMed] [Cross Ref] 14. Enobakhare B.O., Bader D.L., Lee D.A. Quantification of sulfated glycosaminoglycans in chondrocyte/alginate cultures, by use of 1,9-dimethylmethylene blue. Anal. Biochem. 1996;243:189–191. doi: 10.1006/abio.1996.0502. [PubMed] [Cross Ref] 15. Lee C.S.D., Gleghorn J.P., Won Choi N., Cabodi M., Stroock A.D., Bonassar L.J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 2007;28:2987–2993. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.02.035. [PubMed] [Cross Ref] 16. Williams G.M., Klein T.J., Sah R.L. Cell density alters matrix accumulation in two distinct fractions and the mechanical integrity of alginate-chondrocyte constructs. Acta Biomater. 2005;1:625–633. doi: 10.1016/j.actbio.2005.07.009. [PubMed] [Cross Ref] 17. Labarca C., Paigen K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biochem. 1980;102:344–352. doi: 10.1016/0003-2697(80)90165-7. [PubMed] [Cross Ref] 18. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 2009;55:611–622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.[PubMed] [Cross Ref] 19. R Development Core Team . R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria: 2009. 20. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2002;30 doi: 10.1093/nar/30.9.e36. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
21. Cheng T., Maddox N.C., Wong A.W., Rahnama R., Kuo A.C. Comparison of gene expression patterns in articular cartilage and dedifferentiated articular chondrocytes. J. Orthop. Res. 2012;30:234–245. doi: 10.1002/jor.21503. [PubMed] [Cross Ref] 22. Izadifar Z., Chen X., Kulyk W. Strategic design and fabrication of engineered scaffolds for articular cartilage repair. J. Funct. Biomater. 2012;3:799–838. doi: 10.3390/jfb3040799. [PMC free article][PubMed] [Cross Ref] 23. Nishimoto S., Takagi M., Wakitani S., Nihira T., Yoshida T. Effect of chondroitin sulfate and hyaluronic acid on gene expression in a three-dimensional culture of chondrocytes. J. Biosci. Bioeng. 2005;100:123–126. doi: 10.1263/jbb.100.123. [PubMed] [Cross Ref] 24. Nguyen L.H., Kudva A.K., Saxena N.S., Roy K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 2011;32:6946–6952. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.06.014. [PubMed][Cross Ref]
Статьи из Журнала функциональныз иоматериалов (Journal of Functional Biomaterials) предоставлены Институтом междисциплинарных цифровых публикаций (Multidisciplinary Digital Publishing Institute, MDPI)